Окраска по цилю нильсену для чего

Содержание
  1. Окрашивающая основа Ziehl-Neelsen, реагенты и техника / биология
  2. фундамент
  3. Вторичная окраска
  4. Первичная окраска
  5. Обесцвечивающий раствор
  6. Вторичная окраска (анти-краситель)
  7. Приготовить бактериальный мазок
  8. Сушка мазка
  9. Нагреть образец
  10. Прикройте пятно
  11. Нагреть пятно
  12. Вымыть пятно
  13. Покройте мазок кислым спиртом
  14. Покройте мазок красителем
  15. Вымыть пятно
  16. истощать
  17. Изучите мазок в микроскоп
  18. Интерпретировать результаты
  19. ссылки
  20. Окраска по методу Циля-Нильсена и Грама
  21. Область применения метода
  22. Необходимые реактивы и оборудование
  23. Ход процедуры
  24. Показания к применению метода
  25. Метод Грама
  26. Заключение
  27. Окраска по цилю нильсену при сибирской язве
  28. Окраска по Циль-Нильсену
  29. Занятие 4. Окраска спорообразующих и капсулообразующих бактерий. Определение подвижности микроорганизмов
  30. Окраска кислотоустойчивых микроорганизмов
  31. Бактериоскопическое исследование мокроты
  32. Приготовление препаратов для бактериоскопического исследования
  33. Окраска по Цилю-Нильсену
  34. Окраска по Граму
  35. Обеззараживание мокроты, посуды и предметов, бывших в соприкосновении с ней

Окрашивающая основа Ziehl-Neelsen, реагенты и техника / биология

Окраска по цилю нильсену для чего

Окраска Циля-Нильсена в методике окрашивания для выявления устойчивых к действию алкоголя кислотных микроорганизмов (AAR). Название этой микробиологической процедуры относится к ее авторам: бактериологу Францу Цилю и патологу Фридриху Нильсену.

Этот метод представляет собой тип дифференциальной окраски, который подразумевает использование различных красителей для создания контраста между структурами, которые вы хотите наблюдать, дифференцировать и затем идентифицировать. Окраска Циля-Нильсена используется для идентификации определенных типов микроорганизмов.

Некоторые из этих микроорганизмов являются микобактериями (например,, Микобактерии туберкулеза) нокардии (например, Nocardia sp.) и некоторых одноклеточных паразитов (например,, Cryptosporidium parvum). Многие из бактерий могут быть классифицированы с помощью общей техники, называемой окраской по Граму..

Однако некоторые бактериальные группы требуют других методов для их идентификации. Такие методы, как окрашивание по Цилю-Нильсену, требуют сочетания красителей с нагреванием, чтобы сначала прикрепить к клеточной стенке..

Затем происходит процесс обесцвечивания, который дает два результата: устойчивость или чувствительность к обесцвечиванию кислотами и спиртами..

индекс

  • 1 фундамент
  • 2 реагента
    • 2.1 Первичная окраска
    • 2.2 Обесцвечивающий раствор
    • 2.3 Вторичная окраска (анти-краситель)
  • 3 Техника
    • 3.1 Кислотно-быстрое окрашивание
  • 4 Ссылки

фундамент

В основе этой техники окрашивания лежат свойства клеточных стенок этих микроорганизмов. Стенка образована жирными кислотами, называемыми миколиновой кислотой; Они характеризуются очень длинными цепями.

Когда жирные кислоты имеют очень длинную структуру, они могут легче удерживать красители. Некоторые роды бактерий очень трудно окрашивать по Граму, из-за высокого содержания миколевой кислоты в клеточной стенке.

В окраске Циля-Нильсена используется фенольное соединение карбол-фуксин, основной краситель. Это имеет способность взаимодействовать с жирными кислотами клеточной стенки, которая имеет восковую текстуру при комнатной температуре.

Окрашивание карболом фуксина улучшается в присутствии тепла, потому что воск плавится и молекулы красителя быстрее перемещаются в клеточную стенку.

Кислота, которая используется позже, служит для обесцвечивания клеток, которые не были окрашены, потому что их стенка была недостаточно связана с красителем; следовательно, прочность кислотного обесцвечивателя способна удалять кислотный краситель. Клетки, которые противостоят этому обесцвечиванию, называются кислотоустойчивыми.

Вторичная окраска

После обесцвечивания образца это контрастирует с другим красителем, называемым вторичным красителем. Обычно используется метиленовый синий или малахитовый зеленый.

Вторичный краситель окрашивает фоновый материал и, следовательно, создает контраст со структурами, которые были окрашены на первом этапе. Только обесцвеченные клетки поглощают второй краситель (против пятен) и приобретают свой цвет, в то время как кислотостойкие клетки сохраняют красный цвет.

Эта процедура часто используется для идентификации Микобактерии туберкулеза и Mycobacterium leprae, которые называются кислотоустойчивыми бациллами.

Первичная окраска

Карбоксин используется 0,3% фуксина (отфильтрованный). Этот краситель готовят из смеси спиртов: фенол в этаноле (90%) или метаноле (95%), и в этой смеси растворяется 3 грамма основного фуксина.

Обесцвечивающий раствор

На этом этапе вы можете использовать растворы 3% спиртовой кислоты или 25% серной кислоты.

Вторичная окраска (анти-краситель)

Краситель, наиболее часто используемый для контрастирования в образцах, обычно составляет 0,3% метиленового синего. Тем не менее, другие также могут быть использованы, такие как 0,5% малахитовый зеленый.

Приготовить бактериальный мазок

Этот препарат сделан на чистом и сухом предметном стекле, соблюдая меры предосторожности.

Сушка мазка

Разрешить мазок высохнуть при комнатной температуре.

Нагреть образец

Образец должен быть нагрет, применяя огонь к слайду ниже. Фиксация спиртом может быть сделана, когда мазок не был приготовлен с мокротой (обработанной гипохлоритом натрия для отбеливания) и если он не будет окрашен немедленно..

M. tuberculosis Устраняется отбеливателем и в процессе окрашивания. Термофиксация необработанной мокроты не убьет M. tuberculosis, тогда как фиксация алкоголем является бактерицидной.

Прикройте пятно

Пятно покрыто раствором карбол-фуксина (первичное основное пятно).

Нагреть пятно

Это делается за 5 минут. Вы должны заметить выброс пара (примерно 60 ° C). Важно не перегревать и не сжигать образец..

Что касается нагревания пятна, то при нагревании фуксинкарбола следует соблюдать особую осторожность, особенно если окрашивание проводится на лотке или другом контейнере, в котором из предыдущего пятна были собраны легковоспламеняющиеся химические вещества..

Под горками следует наносить только небольшое пламя, используя освещенный тампон, предварительно смоченный несколькими каплями кислого спирта, метанола или 70% этанола. Избегайте использования большого тампона, пропитанного этанолом, потому что это может привести к пожару.

Вымыть пятно

Эта стирка должна быть сделана с чистой водой. Если водопроводная вода не чистая, промойте мазок фильтрованной или дистиллированной водой, желательно.

Покройте мазок кислым спиртом

Этот кислый спирт должен быть на 3%. Покрытие проводится в течение 5 минут или до тех пор, пока мазок не станет достаточно обесцвеченным, то есть бледно-розовым.

Необходимо учитывать, что кислотный спирт легко воспламеняется; поэтому, это должно использоваться очень осторожно. Избегайте быть рядом с источниками возгорания.

Покройте мазок красителем

Это может быть зеленый малахитовый (0,5%) или метиленовый синий (0,3%) краситель в течение 1 или 2 минут, используя самое продолжительное время, если мазок тонкий.

Вымыть пятно

Чистая вода должна использоваться снова (дистиллированная).

истощать

Задняя часть предметного стекла должна быть очищена, и пятно должно быть помещено на дренажную полку, чтобы она была высушена на воздухе (не используйте абсорбирующую бумагу для сушки).

Изучите мазок в микроскоп

Следует использовать объектив 100X и иммерсионное масло. Сканируйте мазок систематически и запишите соответствующие наблюдения.

Интерпретировать результаты

Теоретически, микроорганизмы, окрашенные в красноватый цвет, считаются кислотоустойчивыми (AAR +).

Напротив, если микроорганизмы окрашены в синий или зеленый цвет, в зависимости от красителя, используемого в качестве контр-красителя, они считаются кислотой, устойчивой к воздействию алкоголя (AAR-)..

ссылки

  1. Апурба С. и Сандхья Б. (2016). Основы практической микробиологии (1-е изд.). Jaypee Brothers Медицинские Издательства.
  2. Бауман Р. (2014). Микробиология с заболеваниями по системе организма (4-е изд.). Pearson Education, Inc.
  3. Наследие, Дж., Эванс, Э. и Киллингтон, А. (1996). Вводная микробиология (1-е изд.). Издательство Кембриджского университета.
  4. Морелло, Дж., Гранато, П. Уилсон, М. и Мортон, В. (2006). Лабораторное руководство и рабочая тетрадь по микробиологии: приложения к уходу за пациентами (11-е изд.). Макгроу-Хилл Образование.
  5. Васантхакумари Р. (2007). Учебник по микробиологии (1-е изд.). B.I. Публикации PVT.

Источник: https://ru.thpanorama.com/articles/biologa/tincin-de-ziehl-neelsen-fundamento-reactivos-y-tcnica.html

Окраска по методу Циля-Нильсена и Грама

Окраска по цилю нильсену для чего

Окраска по Цилю-Нильсену – это один из методов, используемый для обнаружения при исследовании анализов больного различных заболеваний. В случае изучения мокроты пациента на предмет наличия возбудителей, к примеру, туберкулеза широко используется данный метод. В этой статье пойдет речь о нюансах его проведения, а также о некоторых аналогичных методах.

Область применения метода

Этот метод окрашивания используется в тех случаях, когда необходимо выявить в образце кислотоустойчивые микроорганизмы, к которым относятся возбудители туберкулеза, проказы и микробактериозов.

Такие бактерии характеризуются, прежде всего, медленной скоростью роста, общими морфологическими особенностями, а также устойчивостью к кислотам и некоторым другим химическим веществам. Из-за последнего свойства такие бактерии плохо поддаются окраске обычными разведенными красителями.

Для окрашивания таких бактерий на препарат наносится и в дальнейшем поджигается фуксин Циля, причем полученная окраска не исчезает под воздействием спирта и кислот.

Необходимые реактивы и оборудование

Для проведения окраски образца по методу Циля-Нильсена необходимы следующие реактивы:

  • Метиленовый синий с 10%-ным содержанием спирта;
  • Раствор солянокислого спирта;
  • Фуксин Циля, состоящий из фенола, фуксина и этилового спирта в количестве 50 г, 10 г и 10 г соответственно.

Также потребуется следующие инструменты:

  • Газовая горелка;
  • Часы для слежения за временем;
  • Вода;
  • 96%-ный этиловый спирт;
  • Перчатки.

Ход процедуры

Окрашивание по методу Циля-Нильсена состоит из следующих этапов:

  1. На мазок, находящийся на предметном стекле, накладывается фильтровальная бумага, на которую затем наносится небольшое количество фуксина Циля.
  2. Затем предметное стекло нагревается до появления характерного пара. После появления пара стеклу нужно дать остыть. Затем нужно повторить эту процедуру еще 2 раза, а затем дать подогретому мазку остыть.
  3. После этого нужно смыть фуксин с приборного стекла, предварительно убрав бумагу, с помощью дистиллированной воды.
  4. Затем стекло помещается в раствор соляной или серной кислоты до полного обесцвечивания.
  5. Наконец, на обесцвеченный препарат наносится раствор метиленового синего. Стекло промывается дистиллированной водой и высушивается для дальнейшего исследования образца под микроскопом.

Рекомендуем прочитать! Перейдите по ссылке:  МСКТ органов грудной клетки

Липиды, которые содержатся в клеточной стенке кислотоустойчивых бактерий, хорошо удерживают цвет основного красителя. В некислотоустойчивых бактериях стабильно удерживается цвет как основного красителя, так и дополнительного.

Показания к применению метода

При подозрениях на туберкулез исследуется мокрота больного. Длительный кашель с обильными выделениями является показанием для проведения подобного исследования.

Визуально наличие возбудителей туберкулеза в организме может выдать мокрота характерной жидкой, пенистой консистенции и признаками гноя, а также мокрота, смешанная с кровью.

Обнаружение возбудителей туберкулеза – рисовидных телец, известных также как линзы Коха, облегчается при использовании методов окраски образца. Таких как вышеописанный метод Циля-Нильсена или метод Грама, суть которого будет описана ниже.

Метод Грама

Окраска препарата по методу Грама проводится следующим образом:

  • Сперва препарат обрабатывается раствором Люголя на протяжении минуты;
  • Затем препарат обесцвечивается с использованием спирта;
  • Наконец, препарат промывается с использованием воды и дополнительно окрашивается фуксином.

Классификацию бактерий на грамположительные и на грамотрицательные можно наглядно увидеть при проведении подобной окраски. Первый тип бактерий окрашивается в темно-фиолетовый цвет, тогда как второй тип – в красный цвет. Исходя из такой классификации, можно судить о химическом составе клеточной стенки бактерии и о других ее характерных свойствах.

Заключение

Анализ мокроты пациента является жизненно необходимым для своевременного выявления заболеваний, затрагивающих дыхательные пути, в том числе и туберкулеза.

Окрашивание по методу Циля-Нильсена помогает выявить микроорганизмы и возбудители подобных болезней. В том числе и в случаях, когда речь идет об атипичных бактериях.

Тем самым позволяет производить более точную и качественную диагностику подобных болезней.

Источник: https://ChahotkiNet.ru/diagnostika/analizy/okraska-tsilya-nilsena-i-grama

Окраска по цилю нильсену при сибирской язве

Окраска по цилю нильсену для чего

В природе существует группа микроорганизмов, устойчивых к действию кислот, щелочей и спиртов. Они относятся к роду Mycobacterium(возбудители туберкулеза, паратуберкулеза крупного рогатого скота, проказы человека).

Химическая структура цитоплазмы и клеточной оболочки микроорганизмов данной группы отличается содержанием значительного количества жировосковых веществ, в частности стеариновых кислот (в том числе фтионовой кислоты до 40%), поэтому проникновение красителя в клетку затруднено.

Для их окраски используют протравливание (нагревание мазка с красителем над пламенем). Окрасившись, они прочно удерживают краску и не обесцвечиваются кратковременным

действием кислоты.

Окраска по Циль-Нильсену

1. Фиксированный на пламени мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги, наливают на нее карболовый раствор фуксина и подогревают; при появлении паров прекращают нагревание и оставляют краску на препарате еще на несколько минут (2—3 минуты). Дав препарату остыть, удаляют пинцетом бумажку и

обмывают мазок водой.

2. Обесцвечивают препарат 5—10% водным раствором серной кислоты в тече­ние 3—5 секунд (до желтоватого оттенка мазка). Вместо серной кислоты можно применить 5% раствор

азотной или 3% раствор соляной кислоты.

  1. Мазок тщательно
    промывают водой.

  2. Споласкивают
    96°спиртом.

5. Снова промывают
водой.

6. Докрашивают в течение 3—5 минут леффлеровской метиленовой синькой или водным раствором 1: 1000 малахитовой зе­лени или метиловой

зелени.

7. Краску смывают
водой и препарат высу­шивают.

Микроскопическая картина: туберкулезные палочки — рубиново красные, остальные, за исключением возбудителя паратуберкулеза, кислото — и спиртоустойчивых сапрофитов, — синие.

Для обесцвечивания мазков при окраске по Циль-Нильсену вместо растворов кислот и спирта особо рекомендуется применение солянокислого алкоголя (соляной кислоты 3 мл+96° спирта 97 мл) до слабо заметного розоватого оттенка препарата. После этого мазок ополаскивают водой и докрашивают метиленовой синькой и т. д. по основной прописи.

Указанным методом достигается одновременное испытание бацилл на кислото — и спиртоустойчивость. Среди видов кислотоустойчивых сапрофитов встречаются спиртоподатливые разновидности, палочки же туберкулеза и паратуберкулеза всегда кислото — и

спиртоустойчивы.

Занятие 4. Окраска спорообразующих и капсулообразующих бактерий. Определение подвижности микроорганизмов

Цель занятия.Усвоить методы окраски спорообразующих, капсулообразующих бактерий, а также

определение подвижности бактерий.

Материалы и
оборудование
. Взвеси бактерий с вакцинным штаммом сибирской язвы, клостридиями, готовые препараты с капсулообразующими бактериями, подвижные бульонные культуры эшерихий 18 часового роста, предметные и покровные стекла, плакаты, 2% раствор сафранина, водный раствор малахитовой зелени, карболовый

фуксин Циля.

Методические
указания
. Каждый студент готовит мазки из взвесей микроорганизмов и окрашивает их по методу Трухильо, Ольта, микроскопирует и зарисовывает; готовит препарат для изучения подвижности микроорганизмов методом «раздавленная»

и «висячая» капля.

Окраска спор. При неблагоприятных условиях для микробов (отсутствие питательной среды, высушивание, неблагоприятная температура и др.) в цитоплазме некоторых микроорганизмов образуются споры. Формируются они внутри вегетативной клетки, являясь эндоспорами.

Палочковидные грамположительные микроорганизмы, образующие округлые споры, диаметр которых не превышает ширину микробной клетки, относятся к родуBacillusи называются бациллами. Микроорганизмы родаClostridiumимеют споры диаметр которых превышает ширину микробной клетки и называются клостридиями.

По форме они бывают

овальные и круглые (рис. 5).

Споры устойчивы к воздействию высоких температур, химических веществ, к высыханию, длительно сохраняются в почве, что объясняется их особым строением и химическим составом, в особенности ее оболочки. Поэтому споры стойки к действию

красителей.

Все методы окраски спор основаны на обеспечении проникновения красителя через трудноокрашиваемую оболочку споры. Поэтому применяют протраву. После охлаждения оболочка вновь становится плотной и не пропускает

дополнительный краситель.

Техника окраски
спор методом Трухильо
. На фиксированный мазок накладывают небольшой кусочек фильтровальной бумаги и на нее наносят

водный раствор малахитовой зелени.

Рис.
5. Споры микроорганизмов различных типов

Подогревают препарат на пламени горелки до появления паров и выдерживают в течение 3 минут, промывают водой и докрашивают 0,25%-ным водным раствором основного фуксина 1 минуту. Промывают водой и высушивают. Микрокартина: споры зеленые, а вегетативные

клетки красные.

Окраска капсул. Тело микробной клетки покрыто рыхлым слизистым слоем. У некоторых видов микроорганизмов этот слой развивается очень сильно и тогда он называется капсулой.

Капсула — муциноподобное вещество, высокомолекулярный полисахарид, является производным наружного слоя оболочки.

Наличие капсулы является важным диагностическим признаком при идентификации и дифференциации возбудителей некоторых инфекций (сибирской язвы, пневмококковой пневмонии и др.) (рис. 6). Патогенные микроорганизмы образуют капсулу в инфицированном организме.

Она является фактором вирулентности и защищает бактериальную клетку от фагоцитоза и бактерицидного действия сыворотки крови. Капсульное вещество плохо окрашивается. Поэтому при приготовлении препарата для обнаружения капсулы выполняют следующие

правила:

а) мазок готовят из свежего материала, так как капсула

быстро лизируется;

б) фиксируют мазок химическим способом, для окраски применяют метохромотические краски, то есть при использовании, которых цитоплазма окрашивается в один цвет, а

капсула — в другой;

в) промывать мазок
водой следует слабо и кратковременно.

Техника окраска
капсул по методу Ольта
. Свежий горячий 2%-ный раствор сафранина наносят на фиксированный мазок, окрашивают 5-7 минут. Быстро промывают водой и высушивают. Тело клетки окрашивается в краснокирпичный

цвет, капсула в — желто-оранжевый.
Определение подвижности бактерий.

Подвижности бактерий важный видовой признак и производиться при диагностических исследованиях: результат учитывают при идентификации микроорганизмов. У подвижных видов способность самостоятельного поступательного (и вращательного)

движения обусловлена наличием жгутиков— специальных тонких нитевидных

образований.

Рис.6.Капсула у бактерий

а ‑ бацилла
сибирской язвы; б — диплококк

Жгутики бывают
различной длины.

Их диаметр настолько мал, что они невидимы в световом микроскопе (менее 0,2 мкм). У разных групп бактерий количество и расположение жгутиков неодинаково. Жгутики плохо воспринимают красители.

Методы сложной окраски искажают подлинный вид жгутиков, поэтому в лабораториях окраску жгутиков не осуществляют, а исследуют бактерии в живом состоянии.

В зависимости от расположения и количества жгутиков

микробы подразделяют (рис. 7):

а) монотрихи — микроорганизмы, имеющие на одном из полюсов один жгутик, движения активные,

поступательные (псевдомонас);

Рис.
7. Типы расположения жгутиков у бактерий

б) лофотрихи— микробы, имеющие на одном из полюсов
пучок жгутиков (листерии);

в) амфитрихи— микробы, имеющие жгутики на обоих
полюсах микробной клетки;

г) перитрихи — микробы, у которых жгутики расположены

по всей поверхности клетки(E.coli).

Есть виды микроорганизмов, обладающие подвижностью, но жгутиков не имеют (спирохеты, лептоспиры). Их движение обусловлено импульсивными сокращениями двигательного фибриллярного аппарата микробной

клетки.

Для определения подвижности у бактерий необходимо использовать культуру не старше суточного возраста, так как старые культуры

утрачивают способность передвигаться.

Определение подвижности бактерий методом «висячая

капля».

Каплю молодой (18-20 часовой) бульонной культуры бактерий бактериологической петлей наносят на покровное стекло. Специальным предметным стеклом с углублением (луночкой) накрывают каплю культуры так, чтобы покровное стекло с каплей находилось в центре луночки и прилипло к предметному стеклу (края луночки предварительно слегка смазывают вазелином). Препарат перевертывают стеклом вверх, и капля «повисает» над луночкой (рис. 8). Препарат микроскопируют при затемненном поле зрения, сначала при малом, затем при среднем или большом увеличении. На

светлом фоне микробы темно-серые.
Методом Шукевича.
Для этого каплю

микробной взвеси наносят в конденсат скошенной плотной питательной среды в пробирке. Подвижные микроорганизмы, передвигаясь из конденсата, растут на поверхности среды; неподвижные виды размножаются только в конденсате среды

(«не заходя» на поверхность агара).

Рис. 8. Исследование микробов на подвижность

а ‑ стекло с луночкой; б ‑ «висячая

капля»

Метод «раздавленная
капля».
Каплю бактериальной взвеси наносят на обычное предметное стекло, осторожно накрывают покровным стеклом и слегка придавливают пальцем. Микроскопию проводят, так же как и в методе «висячая

капля».

Метод посева
уколом в полужидкий агар.
Для этого бактериологическойпетлей производят посев исследуемой культуры уколом до дна пробирки с полужидкой питательной средой. Подвижная культура растет по всей питательной среде, образуя равномерное помутнение, а неподвижная — только по уколу в виде стержня, сохраняя прозрачность незасеянного участка

среды.

ЗАНЯТИЕ 5. Лабораторная посуда и её подготовка. Питательные среды. Методы приготовления и стерилизации питательных сред. Методы

стерилизации лабораторной посуды.

Цель занятия.
Подготовить посуду. Приготовить питательные среды. Определить рН сред. Ознакомиться с методами стерилизации

питательных сред и лабораторной посуды.

Оборудование и
материалы.
Штативы, пробирки, микробиологические петли, пипетки,

чашки Петри, бумага. Автоклав,

сушильный шкаф. Набор сред и химических

реактивов. рН -метр.

Источник: https://dingodesign.ru/okraska-po-cilju-nilsenu-pri-sibirskoj-jazve/

Окраска кислотоустойчивых микроорганизмов

Окраска по цилю нильсену для чего

В природе существуетгруппа микроорганизмов, устойчивых кдействию кислот, щелочей и спиртов. Ониотносятся к роду Mycobacterium(возбудители туберкулеза, паратуберкулезакрупного рогатого скота, проказычеловека).

Химическая структура цитоплазмыи клеточной оболочки микроорганизмовданной группы отличается содержаниемзначительного количества жировосковыхвеществ, в частности стеариновых кислот(в том числе фтионовой кислоты до 40%),поэтому проникновение красителя вклетку затруднено.

Для их окраскииспользуют протравливание (нагреваниемазка с красителем над пламенем).Окрасившись, они прочно удерживаюткраску и не обесцвечиваются кратковременнымдействием кислоты.

Бактериоскопическое исследование мокроты

Окраска по цилю нильсену для чего

Для проведения данных исследований необходимо следующее оснащение рабочего места:

  1. Предметные и покровные стекла.
  2. Шпатели и иглы.
  3. Смесь Никифорова.
  4. Газовая или спиртовая горелка.
  5. Пастеровская пипетка с резиновым баллончиком.
  6. Водяная баня с мостиком.
  7. Иммерсионное масло.
  8. Микроскоп.
  9. Фильтровальная бумага.
  10. Пинцеты Корне.
  11. Бумажки Синева.
  12. Основной фуксин.
  13. 96° этиловый спирт.
  14. Фенол.
  15. Глицерин.
  16. Концентрированная соляная кислота.
  17. Метиленовая синька.
  18. Дистиллированная вода.
  19. Генцианвиолет.
  20. Реактив Люголя.
  21. Едкий натр (NaOH).
  22. Бензин или ксилол.

Приготовление препаратов для бактериоскопического исследования

Для бактериоскопического исследования готовят обычно два препарата: один для обнаружения микобактерий туберкулеза и другой для обнаружения прочих микроорганизмов.

Для первого препарата отбирают те же частицы, которые были предназначены для микроскопии, для второго — гнойные частицы.

Взятый материал распределяют по предметному стеклу до получения достаточно тонкой ажурной сеточки (материал на первом стекле распределяют на 2/3 его поверхности, на втором — в центре).

Оба препарата фиксируют троекратным проведением над пламенем горелки. Первый препарат окрашивают по Цилю — Нильсену, второй — по Граму.

Окраска по Цилю-Нильсену

Для окраски препаратов по Цилю-Нильсену необходимы следующие краски и реактивы:

  1. Фуксин Циля: основного фуксина 1 г, глицерина 4 капли, этилового спирта 96° 10 мл, карболовой кислоты (5% раствор фенола) 5 мл, дистиллированной воды 90 мл. К фуксину, помещенному в фарфоровую ступку, прибавляют глицерин, хорошо растирают, постепенно приливают карболовую кислоту, спирт и воду. Фильтруют.
  2. 3% раствор солянокислого спирта: 3 мл концентрированной соляной кислоты удельного веса 1,19 и 97 мл 96° этилового спирта.
  3. 0,2 % водный раствор метиленовой синьки — 1 г метиленовой синьки растворяют в 500 мл дистиллирован- вой воды.   

Техника окраски. На фиксированный препарат кладут полоску фильтровальной бумаги (уже и короче предметного стекла), на которую наливают в избытке фуксин Циля.

Затем препарат нагревают до появления паров (достаточно троекратно медленно провести его над пламенем горелки), дают ему остыть в течение 3-5 минут, сбрасывают с помощью пинцета бумажку, промывают препарат водой и наливают на него 3% раствор солянокислого спирта для обесцвечивания на 20 секунд. После этого препарат промывают водой и вновь повторяют обесцвечивание. Материал должен быть серовато-розового цвета. Затем на препарат на 20-30 секунд наливают 1: 500 водный раствор метиленовой синьки, краску сливают, препарат промывают водой и высушивают, установив в вертикальном положении на полоску фильтровальной бумаги.

Высушенный препарат рассматривают под микроскопом с иммерсией, с поднятым конденсором.

В препарате микобактерии туберкулеза (рис. 60) красного цвета, нежные, тонкие, слегка изогнутые, иногда зернистые. Иногда обнаруживают микобактерип туберкулеза в виде так называемых осколков (в составе тетрады Эрлиха).

Рис. 60. Микобактерии туберкулеза в мокроте. 1 – окраска по Цилю-Нильсену, 2 – в люминесцентном микроскопе.

Все остальные элементы, в том числе и другие микроорганизмы, окрашены в синий цвет. С целью обнаружения мпкобактерий туберкулеза препарат тщательно исследуют, продвигая от одного продольного края к другому и поперек мазка.

Во всех сомнительных случаях рекомендуют обработать препараты жавелевой водой
Результат исследования оформляют, используя следующую формулировку: «микобактерип туберкулеза не обнаружены» или «микобактерип туберкулеза обнаружены», и отмечают приблизительное их количество, например, «единичные в препарате», «единичные в поле зрения» и т. д.

В настоящее время находит все большее распространение люминесцентный способ обнаружения микобактерий туберкулеза в мокроте. Микобактерип туберкулеза имеют золотисто-желтое свечение на черном фоне препарата (рис. 60, 2).

В тех случаях, когда количество микобактерий туберкулеза в мокроте незначительно, для их обнаружения применяют метод обогащения (флотация), который состоит в следующем. В бутылку с нешироким горлышком (емкостью 250 мл) помещают 12-20 мл мокроты, добавляют равный объем 0,5% раствора КОН и встряхивают 5-10 минут.

Затем приливают около 10 мл дистиллированной воды и 0,5-1 мл бензина или ксилола, взбалтывают 10-15 минут и доливают дистиллированную воду гак, чтобы горлышко бутылки было заполнено. Смесь оставляют на 1-2 часа до образования на поверхности жидкости сливкообразного слоя.

На два предметных стекла, заранее расположенных на мостике над водяной баней, нагретой до 60-65°, каплями, с помощью пастеровской пипетки, 5-6 раз наносят сливкообразный слой, каждый раз после подсыхания предыдущей капли.

Мазки окрашивают фуксином Циля на водяной бане (без дополнительной фиксации) в течение 10 минут, промывают водой, 3-4 минуты обесцвечивают 3% раствором солянокислого спирта, вновь обмывают водой, докрашивают 0,2% водным раствором метиленовой синьки, высушивают и исследуют под микроскопом.

Окраска по Граму

Для окраски препаратов по Граму требуются следующие краски и реактивы:

  1. Разведенный фуксин Циля (фуксин Пфейффера): 1 часть фуксина Циля + 9 частей дистиллированной воды.
  2. Реактив Люголя.
  3. 1 % спиртовой раствор генцианвиолета — 1 г генцианвиолета растворяют в 100 мл 96° этилового спирта. Этот раствор краски можно заменить бумажкой, приготовленной по методу Синева (белую фильтровальную бумажку пропитывают 1% спиртовым раствором генцианвиолета, затем высушивают и разрезают на мелкие квадратики соответственно размеру мазка).

Техника окраски. На фиксированный препарат накладывают бумажку Синева и смачивают ее водой (при отсутствии бумажки Синева ее заменяют белой фильтровальной бумажкой, на которую наносят несколько капель 1% спиртового раствора генцианвнолета). Через 1-2 минуты бумажку сбрасывают и на препарат наливают 1-2 капли реактива Люголя.

Через 1-2 минуты препарат обесцвечивают 1-2 каплями 96° этилового спирта до появления бледно-серой окраски материала, смывают водой, на 10-15 секунд наносят сруксин Пфейффера, после чего вновь смывают водой и высушивают. В препаратах могут быть обнаружены (рис.

61) стафилококки, стрептококки, диплококки, палочки Пфейффера, спирохеты Плаута-Венсана, актиномицеты и другие микроорганизмы.

Рис. 61. Различные микроорганизмы в мокроте: диплококки (1), палочки Пфейффера (2), стрептококки (3), стафилококки (4), диплобациллы Фридлендера (5), симбиоз Венсана (6), мицелий актиномицет (7).

Обеззараживание мокроты, посуды и предметов, бывших в соприкосновении с ней

После проведенного исследования мокроту сжигают или обеззараживают. Последнее достигается следующими способами: а) автоклавированием в течение одного часа при 1,5 атм.

; б) кипячением в течение одного часа в 1-2% растворе соды; в) обработкой 5% раствором лизола, карболовой кислоты или смесью, состоящей из равных объемов 5% раствора хлорамина и 5% раствора сернокислого аммония, в течение 12-24 часов.

После обеззараживания посуду тщательно моют водой и высушивают.

Металлические предметы (шпатели, иглы) обеззараживают прокаливанием над огнем. Во избежание переноса микроорганизмов из одной порции мокроты в другую шпатель и иглу немедленно прокаливают после отбора соответствующих частиц.

Покровные стекла опускают в небольшую плоскую чашечку с 40% раствором серной кислоты на 12-24 часа. Затем кислоту сливают, а стекла неоднократно промывают водопроводной и дистиллированной водой. Вымытые стекла высушивают и используют для последующих исследований.

Источник: http://ginekolog.my1.ru/publ/klinicheskie_issledovanija/mokrota/bakterioskopicheskoe_issledovanie_mokroty/40-1-0-771

Самое полезное
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: